免疫球蛋白怎么买 狂犬病人免疫球蛋白低pH孵放工艺的病毒灭活验证

狂犬病人免疫球蛋白低pH孵放工艺的病毒灭活验证

张航,容新宗,黄琰,梁洪,刘波,李小姣,吴佳君,秦婷婷.狂犬病人免疫球蛋白低pH孵放工艺的病毒灭活验证[J].中国生物制品学杂志,2020,33(11):1312-1316.

北京天坛生物制品股份有限公司

成都生物制品研究所有限责任公司

成都蓉生药业有限责任公司

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003204

低pH孵放法

对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。应用于血液制品的病毒灭活/去除方法有低 pH 孵放法、S/D 法、干热法、巴氏消毒法、辛酸钠处理法和纳米膜过滤法等，而低 pH 孵放法是国内企业常用的免疫球蛋白类产品的病毒灭活方法。该方法不仅能保持免疫球蛋白活性，同时在保证制品病毒安全性上发挥着重要作用。

该研究选取4种脂包膜病毒验证低pH孵放法病毒灭活工艺对狂犬病人免疫球蛋白病毒灭活的效果及对制品质量的影响。

01材料与方法

1.1 样品

低pH孵放灭活前样品为连续3批狂犬病人免疫球蛋白生产过程中的原液，于2~8℃保存，由成都蓉生药业有限责任公司提供。第1批蛋白浓度为54.5mg/mL，pH 4.3；第2批蛋白浓度为54.6mg/mL，pH 4.2；第3批蛋白浓度为54.3mg/mL，pH 4.2。

1.2 病毒及细胞

伪狂犬病毒（pseudorabiesvirus，PRV）由中国兽医监察所提供，培养用细胞为猪肾细胞（PK-15细胞）；水疱性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV）由中国食品药品检定研究院提供，培养用细胞为非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）；辛德毕斯病毒（sindbisvirus，SV）由ATCC提供，培养用细胞为乳仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）；各病毒培养用细胞均购自ATCC。人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）灭活效果验证委托中国人民解放军艾滋病检测确认实验室开展，使用的病毒为HIV-1ⅢB株，培养用细胞株为MT4细胞。

1.3 主要试剂

MEM基础培养液和0.25%胰酶消化液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。

1.4 病毒灭活效果验证

1.4.1 中性样品制备

将3批狂犬病人免疫球蛋白原液用1mol/L NaOH调pH至7.1±0.1。

1.4.2 指示病毒加入

将低pH样品（狂犬病人免疫球蛋白原液）和中性样品用0.22μm一次性滤器除菌过滤。按9∶1的比例分别加入指定病毒，混匀，1mL/支分装。低pH样品（0d）立即用1mol/L NaOH调pH至中性，中性样品（0d）则加入同体积灭菌注射用水，于-70℃及以下条件冻存备用。

1.4.3 孵放

将样品于（24±1）℃孵放。PRV、VSV和SV灭活验证时分别于孵放后1、3、5、7、14、21d取样；HIV灭活验证时于4、7、14、21d取样。

1.4.4 孵放后样品处理

所有低pH样品取出后，立即用1mol/L NaOH调pH至中性，中性样品则加入同体积灭菌注射用水，以保持系统一致性。处理后样品置-70℃冻存备用。

1.4.5 病毒滴度检测

PRV、VSV和HIV采用微量CPE法：即将待测病毒及样品作10倍系列稀释后，接种于长满单层敏感细胞的96孔细胞板内，每个稀释度接种8孔，0.1mL/孔，置于37℃，5% CO2培养箱培养；7d后记录CPE结果，按Karber法计算病毒滴度（LogTCID50/mL）。SV采用蚀斑形成PFU法：即将待测病毒及样品作10倍系列稀释后，接种于长满单层敏感细胞的6孔细胞板内，每个稀释度接种2孔，0.2mL/孔，吸附1.5h后，加入1.5%甲基纤维素固定，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；3d后用无水乙醇固定，再用0.03%亚甲蓝染色，记录空斑数，按下式计算。每批样品重复测定2次，取平均值。

病毒滴度（LogPFU/mL）=每孔平均空斑数/（病毒稀释度×病毒接种量）

1.4.6 结果判定

灭活病毒滴度值即中性样品（0d）病毒滴度值与低pH样品（21d）病毒滴度值的差值。若灭活病毒滴度值≥4.00Log，可认定为有效的灭活病毒方法。

1.5 低pH孵放病毒灭活工艺对狂犬病人免疫球蛋白质量影响的检测

狂犬病病毒抗体效价检测采用《中国药典》三部（2015版）中狂犬病免疫球蛋白效价测定法第二法快速荧光灶抑制试验法；纯度检测采用《中国药典》三部（2015版）中醋酸纤维素薄膜电泳法；分子大小分布（IgG单体加二聚体含量）检测采用《中国药典》三部（2015版）中人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法。

02结果

2.1 低pH孵放对PRV的灭活效果

PRV第1、2、3批灭活病毒滴度值分别为≥4.94、≥5.06和≥5.25LogTCID50/mL，均≥4.00Log。表明连续3批狂犬病人免疫球蛋白经低pH孵放后，可有效灭活PRV。

PRV滴度&PRV动力学曲线

2.2 低pH孵放对VSV的灭活效果

VSV第1、2、3批灭活病毒滴度值分别为≥5.88、≥5.56和≥5.75LogTCID50/mL免疫球蛋白怎么买，均≥4.00Log。表明连续3批狂犬病人免疫球蛋白经低pH孵放后，可有效灭活VSV。

VSV滴度&VSV动力学曲线

2.3 低pH孵放对SV的灭活效果

SV第1、2、3批灭活病毒滴度值分别为>8.07、>8.08和>7.80LogPFU/mL，均≥4.00Log。表明连续3批狂犬病人免疫球蛋白经低pH孵放后，可有效灭活SV。

SV滴度&SV动力学曲线

2.4 低pH孵放对HIV的灭活效果

HIV第1、2、3批灭活病毒滴度值分别为≥7.17、≥7.83和≥6.73LogTCID50/mL，均≥4.00Log。表明连续3批狂犬病人免疫球蛋白经低pH孵放后，可有效灭活HIV。

HIV滴度&HIV动力学曲线

2.5 低pH孵放病毒灭活工艺对狂犬病人免疫球蛋白质量的影响

经pH孵放病毒灭活处理后，3批狂犬病人免疫球蛋白的纯度和分子大小分布保持稳定，抗体效价与灭活前差异均在方法允许的波动范围内。表明低pH孵放对狂犬病人免疫球蛋白的质量无影响。

03讨论

免疫球蛋白类制品的原料为人血浆，为了排除病毒污染的风险，需严格把控血浆的采集和检测程序，保证原料血浆的质量，同时在生产过程中加入适合的病毒去除/灭活步骤，保证制品质量的同时保障病毒安全性。

在选择病毒灭活/去除方法时，应平衡病毒安全性和蛋白质活性损失的风险。免疫球蛋白类制品在低pH环境表现的更加稳定，可避免IgG聚合或裂解，且低pH孵放法不需增加其他成分去除步骤，因此是免疫球蛋白类制品制备工艺中常用的病毒灭活步骤。在狂犬病人免疫球蛋白制备工艺研究中，低pH孵放步骤对所选的4种脂包膜病毒的灭活能力均在4.00Log以上，表明其对脂包膜病毒的灭活是非常有效的。同时，通过对低pH孵放前后样品的质量指标比较免疫球蛋白怎么买，3批制品的纯度、IgG单体加二聚体含量以及抗体效价均未受到病毒灭活步骤的影响，表明低pH孵放法不仅能够保持制品中IgG单体水平，降低裂解物对制品耐受性的影响，还能保证制品的生物学活性，是一种安全有效且简便易行的病毒灭活方法。

单一的病毒灭活/去除方法具有较好的处理病毒效果，但由于病毒性质的多样性，每种方法均有其局限性，无法灭活/去除所有病毒。低pH孵放法能有效去除脂包膜病毒，但病毒灭活效果可能受灭活制品的pH值、蛋白含量、孵放温度、孵放时间、离子强度的影响，且灭活周期较长，容易因参数的失控而影响病毒灭活效果。另外，《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》中指出，从进一步提高免疫球蛋白类制品的安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。巴氏消毒法、纳米膜过滤法等均可用于灭活/去除免疫球蛋白类制品中的非脂包膜病毒。也有报道称多种病毒灭活/去除方法结合使用可有效降低免疫球蛋白制品中脂包膜和非脂包膜病毒量。

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