抗体（antibody）是生化实验常用到的工具，WB、IHC、IP、ELISA等实验都需要买不同的抗体，那么选择一支合适的抗体，我们需要看哪些参数？哪些参数决定了一支抗体的使用范围？本文将概况地聊聊抗体那些事。
Fig1.抗体的一般结构
抗体（Antibody），又称免疫球蛋白（immunoglobulins ,Ig），由重链和轻链构成，重链的分子量在50-75 kDa，轻链在25kDa左右。
重链和轻链WB显影成像大小
Tips: WB检测IP下来的蛋白，能检测到重链和轻链，因此目的蛋白的分子量不能与重链和轻链相近，如果相近，那么二抗必须不一致才能进行检测。
重链根据氨基酸序列和二硫键的不同可分为γ、α、μ、δ、和ε五种，并依此划分免疫球蛋白相应地分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五种。
Table1.不同类型抗体区别
从含量上看，IgG类型免疫球蛋白占比达70%以上，我们常用的抗体类型(Isotype)也就是IgG型免疫球蛋白。
IgG型免疫球蛋白可以进一步划分为4个亚型。
Fig2. 四种IgG抗体亚型
有些抗体，如WB用的抗体，ELISA用的抗体，流式用的抗体在抗体结构上还会结合一些其它的物质帮助成像或发荧光（主要是二抗，二抗一般是在宿主山羊生产）。如图所示，在非抗原结合区添加连接物。
Fig3. 抗体连接物类型和位置
Tips:
WB、 ELISA、 IHC所用二抗识别的是一抗的Fc区域，可结合一抗来源物种的IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五种抗体类型。这类二抗一般会带辣根过氧化酶HRP标记。
IP用的flag抗体、HA抗体、或是myc抗体，可直接连接磁珠；
流式用的抗体会直接带荧光基团（fluorophore）,如FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等，在合适的激发光作用下发光。
决定一个抗体灵敏性和特异性的参数是单抗和多抗。
Primary antibody可分为单抗和多抗两种。单克隆抗体（monoclonal antibody）是单一抗原表位所产生的特异性抗体。多克隆抗体（polyclonal antibody）是多种抗原表位所产生的抗体混合物。
单抗生产过程图示：
单抗制备的核心是杂交瘤技术，用HAT条件筛选培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞，并用ELISA进行抗体效价鉴定。单抗特异性好，但是较多抗昂贵。
Tips:
买抗体时，单抗会标注克隆号（Clone），克隆号是抗体研发中细胞株的编号。以abcam公司的IRS1蛋白为例，方括号中的EP263Y和EP260Y均是克隆号，这两支抗体的单克隆细胞株不相同。
Ref: blog.addgene.org/antibodies-101-monoclonal-antibodies
多抗生产过程图示：
多抗制备的核心是多次免疫宿主（马或是家兔），收集含多抗的血清（抗血清）进行抗体纯化并鉴定。不同宿主产生的抗血清都不一样，具有不稳定性的缺陷。因为多抗可以检测多个抗原表位，所以较单抗特异性差，但也可提高检测的灵敏度。
Ref:blog.addgene.org/antibodies-101-polyclonal-antibodies
重点（被一支抗体白折腾3个月的血泪总结）：确定一支抗体WB显影成像条带是不是目的条带的步骤：1是确认条带与目的蛋白分子量接近；2是准备过表达目的蛋白的细胞裂解液作为阳性对照；3是在目的蛋白N段或是C段加融合蛋白GFP或mCherry，用抗体显影的条带向上偏移（GFP约26kD,mCherry约29kD）；4是进行目的蛋白的敲降，敲降后蛋白条带消失，至此才能完全确定抗体是正确的。
决定一个抗体用途的参数是免疫原。
免疫原（Immunogen）
我们可以看到同一种蛋白会有很多种不同的抗体,如以赛默飞公司的IRS1蛋白抗体为例，总共有48支针对IRS1蛋白的抗体。这些抗体的免疫原各不相同。
制备抗体的免疫原来源有多肽抗原（peptide antigen）和蛋白抗原（protein antigen）。一般来说，天然蛋白（for example,E. coli-derived protein）优于重组蛋白，重组蛋白（recombinant protein）优于多肽（synthesized peptide）。利用多肽制备出的抗体只能识别线性表位，不能够保证得到的抗体可以识别天然蛋白。一般来说，对于需要识别抗原构象表位的下游实验（如CO-IP、FACS、ICC/IF等）不能用多肽制备的抗体完成。
以赛默飞公司的IRS1蛋白抗体为例，因为IRS1蛋白序列具有保守性，所以种属反应范围广。在这个案例中，多肽抗原抗体也能进行ICC等实验。
AB_2532337，免疫原信息是Immunogen Recombinant protein corresponding to amino acids 694–875 of human IRS1，种属反应性：Mouse, Human，用途：WB、ICC、IFC。
AB_2533767，免疫原信息是The antiserum was produced against a chemically synthesized phosphopeptide derived from a region of human IRS-1 that contains serine 312. The sequence is conserved in mouse, rat and pig，种属反应性：Mouse, Human免疫球蛋白在哪里买免疫球蛋白在哪里买，用途：WB、ICC、IFC。
抗体的纯化方式（Purification）
纯化抗体的主要方式是亲和层析，这种方法利用抗体与固定在胶基质上的特定配体的特异、可逆结合将抗体与溶液中其他物质分开，是获得纯净抗体较理想的方法。亲和层析又分为抗原亲和层析（Antigen affinity chromatography）和蛋白A/G亲和层析（Protein A/G purification）两种。
抗原亲和层析
原理简单，就是利用抗原（全部抗原或特异性肽）进行抗体亲和。
蛋白A/G亲和层析
蛋白A或蛋白G是细菌胞壁蛋白，它们能结合抗体Fc段。这一结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化敏感，抗体/蛋白A或蛋白G的亲和力随pH值的降低而急剧降低，利用这一特性可进行抗体纯化。
二抗的常识
有一天，我看到了抗体说明书写着二抗用Goat anti-Rabbit，无知的我转头就问师兄师姐，这是什么意思？我只知道Rabbit和Mouse二抗，哪里来的goat？师兄惊讶地对我说，二抗在哪里产生的，你不会连这都不知道吧？我的确不知道，不知道！！！这才意识到自己平时太瞎了。查询才知道，二抗是用免疫球蛋白如小鼠的免疫球蛋白IgG免疫宿主如Goat,donkey,rabbit(除小鼠外的其它物种，以Goat最为常见)，这样产生的二抗可以识别IgG的重链和轻链及和IgG有相同轻链的IgM免疫球蛋白。
总的来说，在选择一支抗体时，可以先查阅其它文献中使用的抗体货号，文章可信的话，买来的抗体也会比较好用。在没有其它文献参考的情况下，买abcam，赛默飞，cst，sigma等公司的抗体比其它公司好；买单抗比多抗好；买免疫原是重组蛋白或是天然蛋白比免疫原是合成多肽的好。买回抗体后，也可自行摸索一下抗体合适的使用浓度和封闭条件，以达到最佳成像效果。买回来尝试了不好用，不管是哪个公司的产品，立即联系销售退换货。这次总结到此，祝大家科研顺利！
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